Témoignage – Lymphome de bas grade

Témoignage – Lymphome de bas grade

Bonjour,
Je me permets de vous contacter, d’abord pour vous remercier de vos recherches, mais aussi pour témoigner et vous apporter le « feedback » nécessaire à vos recherches.

Ma maman, âgée de 77 ans, a été diagnostiquée d’un lymphome de bas grade, suite à une IRM du bassin, effectuée pour d’autres raisons. Il était classé stade 4, disséminé.
Il est important de préciser qu’elle avait déjà eu un lymphome diagnostiqué en 1994, avec une bosse sur le front. Ce dernier avait fait l’objet d’une biopsie, révélant son caractère malin. Ma Mère avait alors suivi un traitement en micro-immunologie, et avant de se faire opérer, avait demandé une deuxième biopsie qui s’était avérée… négative !
Plus d’alerte pendant 25 ans, ce qui semble assez courant dans les lymphomes à bas grade, jusqu’à cette IRM de 2019.

Abasourdi par cette nouvelle, j’ai commencé mes recherches et découvert vos travaux sur le traitement métabolique, et les travaux de Thomas Sigfried. Elle a suivi pendant ce temps le parcours de soin «normal»,  avec une biopsie, rendez-vous chez l’oncologue, etc… la machine implacable se mettant en marche !

J’ai commandé l’AAL et l’hydroxycitrate sous forme composée, de marque Vit’all+ (500mg de Carnicia et 100mg d’AAL par gélule). Le dosage n’est pas celui qui est recommandé, mais il faut savoir que ma mère prend déjà beaucoup de médicaments, et je souhaitais limiter la complexité du « traitement »…

Elle a donc commencé le 4 septembre 2019 à prendre deux gélules par jour (donc 600 d’hydroxycitrate et 200mg d’AAL), avec aussi du Xaventin (germe de blé fermenté).
En accord avec son oncologue, elle n’a pas entamé de traitement invasif (chimio ou radio), l’évolution du lymphome étant lente.
Il est à noter que ma maman est persuadée que la biopsie réalisée dans l’aine a entraîné une dissémination, car elle s’est retrouvée peu de temps après un nodule sur la cuisse et un autre sur le front !

Je lui ai conseillé par ailleurs de prendre de la vitamine D3 et de la vitamine K2 mk7, afin de booster ses défenses immunitaires. Suivant moi-même avec succès un régime cétogène depuis 2 ans, je lui ai conseillé de faire de même, mais elle n’a pas souhaité s’ajouter cette contrainte… elle ne prend aucun autre traitement pour son lymphome. Je lui avais commandé du bleu de méthylène, mais elle n’a pas supporté la première prise et n’a pas ré-essayé !

En ce début mai 2020, elle vient d’avoir une analyse de sang afin de suivre l’évolution, et les résultats sont surprenants : sa vitesse de sédimentation revenue à la normale, et le dosage des protéines spécifiques sont proches de zéro (0,1) ! Elle n’a par ailleurs aucun symptôme de sa maladie…

Si besoin, je pourrai vous communiquer les résultats détaillés, mais je tenais avant tout à vous remercier pour vos recherches, et pour la diffusion large de celles-ci sur les médias modernes.

Bien cordialement.

Olivier DAVY

Communication du Dr Schwartz

Communication du Dr Schwartz

Chers amis,

La Fondation Guérir du Cancer vient de publier un point d’activité, et certains d’entre vous m’ont demandé de vous en dire un peu plus. Je le fais bien volontiers.

Comme vous le savez, malgré tous les obstacles qui m’ont été opposés, j’ai voué ma vie à soigner le cancer. Avec tous ceux qui m’ont accordé leur confiance, nous avons pu progresser dans la connaissance du cancer et dans le combat contre cette maladie.

J’ai, bien sûr, une pensée toute particulière, et émue, pour ceux, si nombreux, qui nous ont quittés tôt trop, après avoir courageusement lutté, et avant de voir l’aboutissement de nos efforts.

Je pense aussi à vous tous, malades et proches de malades, pour lesquels et aux côtés desquels nous devons continuer à chercher sans relâche, à expérimenter, à approcher toujours plus près des traitements qui nous aideront, enfin, à reléguer cette maladie au rang des pathologies d’antan ou des affections pleinement curables, de celles dont on ne meurt plus, ou presque plus. Nous devons continuer le combat de toutes nos forces et de tout notre cœur.

C’est notamment pour nous aider à gagner ce combat que la Fondation « Guérir du Cancer » a été créée il y a quelques mois.

Cette Fondation, j’en suis convaincu, est une opportunité formidable pour développer des actions de plus grande portée que celles que nous avons pu mener jusqu’à présent. C’est pour cette raison que j’ai soutenu et accompagné cette démarche de Fondation, car je veux, dans l’intérêt de tous les malades, que nous puissions aller plus loin, beaucoup plus loin.

Cette Fondation a été créée en octobre 2019 par des personnes désintéressées qui, comme moi, poursuivent l’objectif de développer les traitements métaboliques contre le cancer ; par des personnes que je connais, et en qui j’ai toute confiance. Toutes les parties prenantes de la Fondation ont en commun de croire en nos recherches et de vouloir les faire aboutir conformément à son projet philanthropique que nous menons sous le contrôle de la Fondation de France, sous la direction indépendante d’un comité exécutif ainsi que sous la validation technique et éthique d’un comité scientifique.

Cette Fondation est, selon moi, essentielle pour l’avenir des recherches sur les traitements métaboliques que nous voulons faire aboutir. Notamment parce qu’elle peut subventionner tous types de démarches scientifiques utiles à notre approche métabolique, entre autres celles d’associations ou d’universités, quelle qu’en soit l’origine.

Mais je veux insister ici sur un point essentiel : cette Fondation ne pourra soutenir des projets que s’ils sont engagés avec toute la rigueur scientifique requise – ce que vérifie son comité scientifique -, et s’ils respectent les réglementations applicables, notamment en ce qui concerne les droits des malades, les essais, la protection des données personnelles, etc.

Et cette rigueur, j’y tiens tout particulièrement, car ce n’est que grâce à elle que les traitements métaboliques, dans lesquels nous plaçons tant d’espoir, pourront sortir de l’anonymat – voire de l’indifférence – dans lequel les défenseurs des traitements dits « conventionnels » veulent les maintenir envers et contre tout. Prouver avec les moyens et les règles de la science que nous avons trouvé, voilà tout l’enjeu !

La Fondation est récente, car elle n’a que 6 mois d’existence. Et pourtant, elle travaille activement, depuis le premier jour, sur des pistes des plus intéressantes.

Ces dernières semaines, je n’ai pas pu m’y consacrer totalement, car je me suis porté volontaire pour soigner les malades du Covid-19, ce qui explique que je n’aie guère eu la possibilité de communiquer auprès de vous, notamment dans un contexte largement perturbé par le confinement.

Mais j’entends revenir sur ce qui a été mis en route par la Fondation.

  • Fin 2019, la Fondation a donné son accord de principe au financement de recherches relatives aux « inhibiteurs de l’enzyme SCOT ». Cette approche, comme un certain nombre d’entre vous le savent maintenant, vise à empêcher les cellules tumorales de se nourrir des cétones qui sont générés par le corps soumis à un régime cétogène. Dans la continuité d’un travail de recherche bibliographique réalisé et publié par le Professeur Maurice Israël, un protocole d’essais a été rédigé puis soumis à différents laboratoires. A ce jour, hélas, aucun d’entre eux n’a formulé de réponse permettant d’entreprendre les essais. Mais nous n’entendons pas renoncer, et les personnes en charge de ce dossier poursuivent leurs efforts pour aboutir le plus rapidement possible à un accord avec un laboratoire et à l’engagement d’essais ; des essais qui, pour être concluants, devront en tout état de cause respecter des protocoles très stricts et qui, par conséquent, risquent de prendre du temps.
  • Début 2020, la Fondation a financé le lancement de recherches menées par le Professeur Mario Jolicoeur au sein du laboratoire de biochimie de Polytechnique Montréal sur le « Rétablissement d’un métabolisme basal chez les cellules cancéreuses par génération contrôlée d’oxygène singulet afin de favoriser leur apoptose». Son titre peut dérouter, mais cette étude s’intègre pleinement dans l’avancement de nos recherches. Elles doivent aboutir à une meilleure compréhension de la possibilité de stimulation de la respiration des cellules cancéreuses par la génération contrôlée d’oxygène mitochondrial. Est en jeu l’amélioration de la connaissance des mécanismes de combustion des sucres dans les cellules tumorales. Le succès de cette recherche pourrait donc permettre de belles avancées des traitements métaboliques du cancer.
  • Parallèlement à ces recherches, des travaux ont montré qu’une vieille molécule comme le Bleu de Méthylène lève l’effet Warburg. Ce traitement s’accompagne d’un ralentissement de la croissance cellulaire. L’effet inhibiteur de croissance est d’autant plus puissant que le Bleu de Méthylène est administré avec de l’acide lipoïque. Ceci conforte l’addition du Bleu de Méthylène au traitement métabolique. Ce travail a été publié dans une revue internationale à comité de lecture.
  • En outre, toujours au plan des traitements métaboliques, il m’apparaît impératif d’acquérir une meilleure connaissance de l’ensemble des approches thérapeutiques identifiables à travers des pratiques d’automédication.

L’université de Bordeaux, représentée par le Professeur Pascal Ragouet, a donc entrepris, avec le soutien de la Fondation, l’élaboration d’une étude observationnelle visant à identifier les meilleures pratiques d’automédication des malades du cancer.

Des questionnaires, déjà construits mais qui entreront bientôt en phase de test ainsi que de validation par des professionnels de santé et des juristes, seront envoyés à des malades, volontaires pour cette étude, afin d’identifier, en fonction des pathologies qui les affectent, quels sont les traitements qu’ils ont suivis, avec quels résultats, quels éventuels effets secondaires, etc. … Le tout, autant que possible, et s’ils le souhaitent, sous le contrôle de leur médecin traitant. Ces questionnaires seront envoyés ensuite 4 fois pour suivre l’état de ces malades.

Les résultats de cette étude devraient bénéficier aux malades du cancer et nous aider à progresser dans la connaissance des traitements métaboliques de façon beaucoup plus globale. Ce processus sera également beaucoup plus rapide que l’exécution de simples essais ponctuels, voire d’essais cliniques sur de nouveaux traitements bien trop lourds et coûteux à mener.

Cette étude prendra environ 1 an parce qu’elle est encadrée par des dispositions législatives et réglementaires nombreuses et strictes, et qu’elle exige, de la part de ses promoteurs, la plus grande rigueur scientifique. C’est sous ces conditions que ses résultats pourront présenter une valeur certaine vis-à-vis du monde médical puis, en conséquence, être reconnus et publiés. J’espère ainsi que vous toutes et tous pourrez partager plus librement vos pratiques d’automédication avec le corps médical.

Chers amis, je reste, plus que jamais, focalisé sur ma vocation de guérir du cancer. J’accepte bien volontiers toutes les collaborations, mais aussi toutes les confrontations d’idées de la part de mes collègues médecins et scientifiques du moment qu’elles sont menées dans un esprit constructif. A vous malades, nous devons d’avancer le plus vite possible pour éclairer la science au service de la lutte contre le cancer.

Je sais que certains d’entre vous contactent la Fondation pour trouver des médecins à consulter. Malheureusement, la Fondation n’a pas les moyens de réaliser ce travail d’intermédiaire ou de recommandation, et je ne peux moi-même vous aider à ce titre. Vous m’en voyez bien désolé.

Avec la Fondation, nous essayerons de publier le plus régulièrement possible un point de situation concernant tous les dossiers intéressants, pour faire part de nos travaux en cours, de nos difficultés mais aussi de nos succès.

Je nous souhaite, à toutes et tous, bon courage en cette période difficile, ainsi que de rester mobilisés dans cette lutte contre le cancer qui nous réunit depuis tant d’années.

Avec mon amitié,

Laurent Schwartz

Combining lipoic acid to methylene blue reduces the Warburg effect in CHO cells: From TCA cycle activation to enhancing monoclonal antibody production

Combining lipoic acid to methylene blue reduces the Warburg effect in CHO cells: From TCA cycle activation to enhancing monoclonal antibody production

Ce travail (Montégut et al. 2020), fait en collaboration avec le Dr. Laurent Schwartz M.D. et le Dr. Jorgelindo Da Veiga Moreira à Polytechnique Montréal dans le groupe du Professeur Mario Jolicoeur, montre qu’une vieille molécule comme le Bleu de Méthylène lève l’effet Warburg. Ce traitement s’accompagne d’un ralentissement de la croissance cellulaire. L’effet inhibiteur de croissance est d’autant plus puissant que le Bleu de Méthylène est administré avec de l’acide lipoïque. Ceci conforte l’addition du Bleu de Méthylène au traitement métabolique. Ce travail a été publié dans une revue internationale à comité de lecture.

Léa Montégut, Pablo César Martínez-Basilio, Jorgelindo da Veiga Moreira, Laurent Schwartz, Mario Jolicoeur
Published: April 16, 2020 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231770

Abstract

The Warburg effect, a hallmark of cancer, has recently been identified as a metabolic limitation of Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, the primary platform for the production of monoclonal antibodies (mAb). Metabolic engineering approaches, including genetic modifications and feeding strategies, have been attempted to impose the metabolic prevalence of respiration over aerobic glycolysis. Their main objective lies in decreasing lactate production while improving energy efficiency. Although yielding promising increases in productivity, such strategies require long development phases and alter entangled metabolic pathways which singular roles remain unclear. We propose to apply drugs used for the metabolic therapy of cancer to target the Warburg effect at different levels, on CHO cells. The use of α-lipoic acid, a pyruvate dehydrogenase activator, replenished the Krebs cycle through increased anaplerosis but resulted in mitochondrial saturation. The electron shuttle function of a second drug, methylene blue, enhanced the mitochondrial capacity. It pulled on anaplerotic pathways while reducing stress signals and resulted in a 24% increase of the maximum mAb production. Finally, the combination of both drugs proved to be promising for stimulating Krebs cycle activity and mitochondrial respiration. Therefore, drugs used in metabolic therapy are valuable candidates to understand and improve the metabolic limitations of CHO-based bioproduction.

 

 

Fig 1. Growth and viability responses of CHO cells to various doses of α-lipoic acid (Α-LA) and methylene blue (MB).
α-LA was tested at 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μm, 200 μM and 500 μM (A) and MB was tested at 10 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM and 10 μM. Growth and viability curves are presented as means ± SEM (n = 3). Specific growth rates were calculated by linear regression during the exponential growth phase, from 0 to 72 h. Statistical significance was determined by one-way ANOVA versus the control culture.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231770.g001

The addition of MB showed no growth inhibition until 500 nM, with cultures at 10 nM, 100 nM and 500 nM behaving similarly to the control (average μ = 0.043 ± 0.002 h-1, Fig 1B). At 1 μM, a minor decrease of the cells specific growth rate was observed (μ = 0.041 ± 0.003 h-1, p = 0.56). Of interest, the viability was maintained at the end of the culture, with 92 ± 1% at 120 h when treated with 1 μM MB compared to 77 ± 3% for the control culture. However, the cells growth rate was significantly reduced at 10 μM (μ = 0.022 ± 0.003 h-1, p < 0.001). Therefore, and following the same criterion as for α-LA, a MB concentration of 1 μM was used in the remainder of the study.

α-LA and MB have distinct significant metabolic effects


The effect of the drugs on cell metabolism was then characterized in shake flask cultures. Drugs were assayed alone as well as combined, and compared to three controls: non-treated (control), treated only with the vehicle used for α-LA administration (0.1% ethanol, control + vehicle) and treated with a known PDH activator (DCA 5 mM). As inferred by our previous observations, similar cell growth and viability behaviors were observed in all cultures (Fig 2A), with a specific growth rate of μ = 0.040 ± 0.002 h-1 and viability higher than 95% until 96 h, except for 100 μM α-LA where cell growth was affected (μ = 0.033 ± 0.002 h-1, p = 0.01, Fig 2A–3). The positive impact of MB on viability was confirmed, with levels of 84 ± 1% for 1 μM MB and 82 ± 3% when combined with 20 μM Α-LA at 120 h, compared to 73 ± 4% for the control (Fig 2A–2).

Fig 2. Metabolic responses after drug administration.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231770.g002
All drugs were added to the culture medium prior to inoculation, with the following conditions: control, 0.1% ethanol (control + vehicle), 5 mM DCA, 20 μM α-LA, 100 μM α-LA, 1 μM MB and 20 μM α-LA combined with 1 μM MB. (A) Cellular growth, viability and specific growth rates were compared to the control. (B) The glucose (GLC) consumption and lactate (LAC) production rates were compared by calculating their ratio (YLAC/GLC). This yield was taken from 0 to 48 h (exponential growth phase) and from 48 to 120 h (late phase), then used to quantify the glycolytic fluxes. (C) Glutamine (GLN) consumption rates were compared to glutamate (GLU) production rates before glutamine depletion (0–72 h), the resulting yield (YGLU/GLN) quantifies the share of glutamine directed to anaplerosis.

Aerobic glycolysis.


Cells glycolytic metabolism was analyzed by comparing glucose consumption to lactate production (Fig 2B). Glucose specific uptake rate (qGLC) and lactate specific production rate (qLAC) were determined in two distinct metabolic phases, taking into account a metabolic shift observed at 48 h. The first phase was calculated from 0–48 h during the exponential growth phase, where both glucose consumption and lactate production fluxes stayed at high levels, with qGLC = 0.22 ± 0.01 μmol/106cells/h and qLAC = 0.36 ± 0.02 μmol/106cells/h for the control group (S1 Fig). The second phase, i.e. late growth phase (48–120 h), was characterized by lower fluxes, with a decrease of 79% for qGLC and 90% for qLAC in the control culture. Similar trends were observed in all conditions (S1 Fig). The YLAC/GLC yield (- qLAC/qGLC) shows that in all conditions most of the uptake glucose undergoes aerobic glycolysis during exponential growth, while this phenomenon is reduced by half during the late growth phase (Fig 2B–3). No significant differences were found when cells were treated with drug vehicle (0.1% ethanol) alone, 20 μM α-LA or its positive control 5 mM DCA. However, 100 μM α-LA resulted in a reduced contribution of aerobic glycolysis, especially during the late growth phase (YLAC/GLC = 0.51 ± 0.01 mol/mol vs. 0.84 ± 0.05 mol/mol for the control). At 1 μM, MB showed to decrease YLAC/GLC both alone and in combination with 20 μM α-LA for the first 48 h, with -19% and -23% versus the control, respectively, and to be similar to the control thereafter.

Glutaminolysis.


Before glutamine depletion, observed at ~72 h in all conditions, all treatments showed strong effects on the glutaminolysis pathway, evaluated from the YGLU/GLN yield (- qGLU/qGLN) at 0-72 h (Fig 2C). Glutaminolysis refers to the efficient use of glutamine, second carbon and nitrogen source, incorporated in the TCA cycle. Cells treated with 5 mM DCA showed a 24% increase of YGLU/GLN, and thus a decreased glutaminolysis phenomenon. However, significant YGLU/GLN increases were observed at 20 μM and 100 μM α-LA, with + 43% and + 48% respectively (Fig 2C–3). It was also observed that supplementing the culture with the drug vehicle (0.1% ethanol) alone caused a slight increase of + 21% in YGLU/GLN, compared to control. Interestingly, the addition of MB at 1 μM showed to favor glutaminolysis with – 24% measured for YGLU/GLN. Finally, when used in combination with MB, the effect of α-LA was predominant with a + 38% increase in YGLU/GLN (Fig 2C–3). Therefore, α-LA and DCA, both drugs known to activate the pyruvate dehydrogenase (PDH) and thus stimulate pyruvate entry into mitochondria, decreased the entry of glutamine in the TCA cycle, while MB increased glutaminolytic anaplerosis.

Drug combination promotes cells OxPhos


The cell specific oxygen consumption rate (qO2) observed for the control culture at 24 h, with qO2 = 0.22 ± 0.02 μmolO2/106cells/h, was similar to previous data obtained with the same cell line [53]. While being maintained during exponential growth phase, qO2 then constantly and strongly decreased (Fig 3A). Such trend was observed in both respiration and leak components of the global qO2 (Fig 3B and 3C). The use of 5 mM DCA increased qO2 and qO2,resp by up to 27% and 38% at 24 h, respectively, compared to control. However, this effect was only maintained for the growth phase, then qO2 values decreased to control level. A concentration of 100 μM α-LA did not initially increase qO2 but, unlike DCA, it kept the respiration level constant until 120 h (Fig 3A), with an approximate 1:1 ratio between respiration and leak (Fig 3B and 3C). No such effect was observed with α-LA at 20 μM or MB at 1 μM, although their combination allowed to partially maintain cell respiration to the end of the culture. At 120 h, combined α-LA and MB led to a qO2,resp value 5.6 times higher than the control (Fig 3B), with a qO2,leak equal to that of control (Fig 3C). Of interest, the combination of the two drugs also perturbed the distribution between leak and respiration at 24 h since, although total qO2 remained unchanged, the leak accounted for 70% of global qO2 instead of 50% for the control (Fig 3C).

Fig 3. Impact of the various treatments on oxygen consumption.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231770.g003
Specific oxygen consumption rates (qO2) were measured for the different treatments with and without the ATP-synthase inhibitor oligomycin A (1 μM) in order to determine the total qO2 (A), its share due to leak qO2,leak (C) and the remaining share due to mitochondrial respiration qO2,resp (B). All values were normalized to the qO2 of their control at 24 h to allow for comparison.

Drugs affect mitochondrial membrane potential and oxidative stress level


The mitochondrial activity was assessed by FACS following two different markers: the mitochondrial membrane potential (MMP), stained by Rhodamine123, and the reactive oxygen species (ROS) generation at the membrane, stained by MitoSOX. We chose the MMP and ROS values of control at 24 h as references for all conditions and compared their evolution to these designated references. The MMP of the control increased with time up to 3-fold after the exponential growth phase (Fig 4A), a trend opposite to that of cell respiration. The addition of 0.1% ethanol (control + vehicle) resulted in a greater but maintained MMP at the end of the culture. Pronounced increases of MMP were observed in both cultures treated with DCA at 5 mM and α-LA at 100 μM, with respective increases of 9.8 and 9.1 times the reference, measured at 120 h. In contrast, 20 μM α-LA culture maintained a low MMP, under 80% of that of the reference. Finally, the addition of MB did not affect MMP, except when combined to 20 μM α-LA where an initial burst was observed at 3.2 times the reference level, while remaining at control level until the end of the culture.

Fig 4. Mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS) levels induced by the drugs.
Mean fluorescence intensity (MFI) was measured by FACS after staining with Rhodamine123 (A) for the mitochondrial membrane potential, and with MitoSOX (B) for the levels of superoxide ions located at the mitochondria. All values are presented as means ± SEM with arbitrary units (normalized versus the MFI of the control at 24 h).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231770.g004
When functioning normally, the electron transport chain (ETC) generates ROS, among which superoxide ions can be stained by the MitoSOX fluorescent dye. The control, drug vehicle and 5 mM DCA (to a lesser extent) conditions showed similar trends, with stable levels at 24 and 72 h, and 1.5 to 2-fold increase at 120 h (Fig 4B). In agreement with their high mortality levels, cells treated with 100 μM of α-LA excessively generated mitochondrial ROS. Finally, at 120 h, instead of the doubling observed for the control, 20 μM α-LA, 1 μM MB and their combination showed decreasing ROS levels with respectively 0.9, 0.6 and 0.5 times the reference value (Fig 4B).
 

MB significantly increases the final monoclonal antibody titer


Maximum mAb titers were reached at 96 h and decreased afterwards (Fig 5A), although not exactly following viability trends (Fig 1). A similar maximum value of 49 ± 3 mg/L was measured for the control, the 20 μM α-LA and 5 mM DCA conditions. The addition of 0.1% ethanol (control + vehicle) resulted in a final production reduction of 20% (Fig 5B). The use of 100 μM α-LA decreased the maximal titer by 67%, and it was not the result of the presence of ethanol alone (p < 0.001, one-way ANOVA vs. control + vehicle). Notably, the addition of MB at 1 μM stimulated the mAb production (+24 ± 5%, p = 0.0013). A positive but non-significant increase (+7 ± 3%, p = 0.25) was also detected when MB was combined to 20 μM α-LA.

Fig 5. Monoclonal antibody (mAb) production and variation of the maximum mAb titer in the extracellular medium for the various drug treatments versus control.
(A) Product titer was determined by ELISA and (B) its effect on mAb production is presented as the percentage of variation versus control.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231770.g005

 

Discussion

Up-regulation of pyruvate dehydrogenase can lead to OxPhos saturation


Two of the three drugs tested (i.e. α-LA and DCA) target the PDH enzyme, which converts pyruvate to mitochondrial acetyl co-enzyme A (AcCoA) rather than to extracellular lactate. However, the expected decrease of global lactate production and of YLAC/GLC has only been observed at 100 μM α-LA,while it was not significant at 20 μM α-LA nor 5 mM DCA (Fig 2B). At 20 μM α-LA, the increase of qLAC was counterbalanced by a slight (but not significant) increase of qGLC (S1 Fig). Although both specific rates increased at 100 μM α-LA, the increase was higher for qGLC than for qLAC, which explains a lower YLAC/GLC. With no significant effect on qLAC or qGLC, our results with DCA differ from Buchsteiner et al. (2018), which may underly some cell line differences. However, both drugs (DCA and α-LA alone or in combination with MB) reduced glutaminolysis (Fig 2C), the main anaplerotic pathway in CHO cells [54, 55], a result mostly due to an increased qGLU (S1 Fig). Martínez et al. (2013) report that CHO cells maintain constant TCA fluxes by reducing glutaminolysis when other anaplerotic fluxes are activated during the glycolysis/OxPhos switch. These results suggest that α-LA and DCA-treated cells may increase their YGLU/GLN ratio in order to compensate for an increased anaplerosis. Indeed, α-LA is known to activate multiple entry-point enzymes to the TCA cycle [56]. A similar conclusion was drawn by Zagari et al. (2013) who used a model of restricted mitochondrial oxidative capacity to explain the codependency of glutamine and lactate metabolisms.

Evaluating the drugs effect on mitochondrial activity homeostasis requires looking at respiratory data. In our work, the enhanced TCA activity from 5 mM DCA was confirmed by an increased total qO2 during exponential growth (0–72 h, Fig 3). However, these increased TCA fluxes resulted, at 120 h, in a mitochondrial imbalance with proton accumulation at the membrane (Rho123, Fig 4A) and a reduction of cellular respiration (Fig 3B). These results agree with the lower ATP concentrations at 5 mM DCA which were previously reported by Buchsteiner et al. (2018). At 100 μM α-LA, the stimulation of TCA cycle activity resulted in a maintained oxygen consumption rate from 0 to 120 h. However, as for our positive DCA control, a significant proton accumulation was observed at the mitochondrial membrane. This mitochondrial saturation at 100 μM α-LA coincided with increased levels of mitochondrial ROS (Fig 4), and proton leak flux (Fig 3C), indicating extreme levels of stress coherent with the observed decrease in cell viability. Also from using Rhodamine123 staining, Hinterkörner et al. (2007) proposed aerobic glycolysis as a mitochondrial pressure relief mechanism, which can be triggered from a high mitochondrial membrane potential. Interestingly, the addition of 20 μM α-LA did not alter the respiration and proton leak rate profiles, while maintaining low mitochondrial membrane potential and ROS levels. The mitochondrial activity and redox balance are strongly dependent on α-LA. It does not only have antioxidant properties but it also acts as cofactor of many mitochondrial enzymes in addition to its action on PDH [57]. For instance, the regulation of complex I production of superoxide anion through its interaction with 2-oxoglutarate dehydrogenase [56] can account in part for the restriction in ROS production (Fig 4). To sum up, α-LA is efficient to manage TCA replenishment and positively regulate the mitochondrial function, but at high concentration such as 100 μM and above, significant changes in mitochondrial metabolism induce damageable stress levels.

Methylene blue enhances the mitochondrial capacity


MB at 1 μM clearly enhanced mitochondrial capacity, a conclusion supported by a coherent set of coordinated effects including lower lactate yield (i.e. more glycolytic flux to TCA cycle), higher glutaminolysis (i.e. more glutamate flux to TCA cycle), control level qO2 and mitochondrial membrane potential, and lower ROS level. MB is a potent redox exchanger acting as an electron shuttle in the mitochondria, bypassing complexes I to III of the ETC and resulting in decreased ROS production [46, 58]. High levels of mitochondrial ROS are associated to high proton leak rates in order to dampen ROS production, thus decreasing ATP synthesis [59]. From these results, we hypothesize that 1 μM MB induces an oxidoreductive “sink” at ETC that pulls on the various anaplerotic pathways to feed the TCA cycle, explaining decreased lactate and glutamate secretion rates (S1 Fig). Such enhanced mitochondrial activity can account for the observed increase in mAb production (Fig 5). Interestingly, coupling α-LA to MB combines the effects of each drug, with a reduced aerobic glycolysis and low ROS levels. The signs of healthy mitochondria are confirmed by the significantly higher qO2 at the end of the culture (Fig 3), although it only translated into a 7 ± 3% increase in mAb production.
 

Conclusion


Our results provide further evidence on the use of metabolic approaches to understand and overcome Warburg effect-related limitations on mAb production by CHO cells.By up-regulating PDH, the α-lipoic acid (α-LA) drug proved efficient at redirecting anaplerotic fluxes towards mitochondria thus increasing TCA activity. However, α-LA above 100 μM disturbs the tightly regulated redox status at the ETC, inducing important stress signals, while 20 μM maintains a minimal stress level. Of interest, the use of methylene blue (MB) at 1 μM showed promising results with increased mitochondrial activity under minimal stress level, and increased mAb production. Although the combination of MB and α-LA led to a less pronounced increase of mAb production than using MB only, it improved cellular respiration. The coordinated actions of pushing on pyruvate entry into mitochondria (α-LA) and pulling on anaplerotic pathways feeding the TCA cycle, while maintaining low ROS level (MB), revealed regulations that confirm the metabolic similarities between CHO and cancer cells.

At the molecular level, metabolic changes can impact mAb quality, i.e. the glycosylation profile and biological activity. Further dedicated studies would be required to identify optimal lipoic acid and methylene blue concentrations and ratios to preserve the mAb molecular properties. We chose to focus on the net production of antibody as it reflects the general metabolic state of the cell. Using this criterium, we showed that, even more than the imbalance between glycolysis and respiration, the mitochondrial capacity was critical for productivity in this CHO cell line. Altogether, the metabolic drugs originating from human therapy proved to be a convenient and efficient tool to study and direct the metabolic regulations of CHO-based bioprocesses.
 

Supporting information

Combining lipoic acid to methylene blue reduces the Warburg effect in CHO cells: From TCA cycle activation to enhancing monoclonal antibody production
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Fig S1. Specific consumption and production rates
Specific consumption and production rates of glucose (A), lactate (B), glutamine (C) and glutamate (D) were measured in the extracellular medium for the various drug treatments. Glycolytic specific rates qGLC and qLAC were calculated on 0-48 h and 48-120 h based on the metabolic shift observed at 48 h. Glutaminolytic rates qGLN and qGLU were calculated before (0-72 h) and after (72-120 h) glutamine depletion. All conditions were statistically compared to the control by one-way ANOVA.

 

Acknowledgments


Authors wish to thank Frédéric Bouillaud for helpful discussions.

 

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Source : https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231770

Ma croisade contre le cancer: Survivre pour guérir autrement

Ma croisade contre le cancer: Survivre pour guérir autrement

 

Cet article relate une expérience personnelle, il ne doit en aucun cas être pris comme exemple, sans un avis et un suivi médical, chaque cas étant différent.

Ce livre raconte mon histoire, l’histoire d’un homme insouciant menant une vie heureuse à Miami, qui, d’un coup, va basculer dans le cauchemar de la maladie dont le seul nom fait peur : le cancer. Le mien est incurable, ou plutôt les miens car la prostate, les os et les ganglions lymphatiques sont touchés. Malgré le très mauvais pronostic de mes oncologues j’ai décidé que je ne mourrai pas du cancer. Vous pensez que c’est impossible ? Pourtant je devrais être en soins palliatifs ou mort au moment où j’écris ces lignes. Le fait est que je ne me suis jamais senti aussi bien depuis des années. Cet ouvrage retrace ma quête pour essayer de survivre plus longtemps et je l’espère guérir. Tout ce que j’ai mis en application dans cette optique se trouve dans ce petit livre-témoignage, que j’ai écrit avant tout dans le but d’aider et de redonner espoir à tous les malades, abandonnés comme moi à leur triste sort par la médecine officielle.

Ce livre est disponible sur Amazon en format Kindle

Témoignage de Yann Patou – Adénocarcinome prostatique et Covid-19

Témoignage de Yann Patou – Adénocarcinome prostatique et Covid-19

Je ne peux que remercier grandement le Dr Schwartz.

Résumé de l’évolution et des traitements d’un Adénocarcinome. Le 10 avril 2020
Après une semaine avec le Covid-19

Diagnostiqué en 2007. PSA pré-op : 4,8.
Prostatectomie radicale + curage ganglionnaire en mars 2008 PSA post-op 0,44 ; tumeur pT3b N1 Mx Gleason 9.
Échec opératoire et traitements adjuvants hormonothérapie (Zoladex) et radiothérapie 48 séances. PSA retombe à 0,01 plus ou moins indétectable, j’évite la chimio.
Hormonothérapie programmée pour 3 ans.

Dès le début je fais énormément de bicyclette (une heure/j/ à fond) j’évite les sucres et je pratique le jeûne de 3 jours.
Arrêt de l’hormonothérapie en Juillet 2011 ; en Juillet 2013 reprise PSA 0,21.
Retour à 0 jusque début 2016 le cancer devient hormono-indépendant.
Changement d’hormonothérapie pour le Décapeptyl 11,25 que je prends toujours.

Depuis mi-2016 je suis différentes combinaisons avec le traitement métabolique de Laurent Schwartz. Régime cétogène +/- strict et metformine 2,5 gr/jour lors d’arrêts de régime cétogène. Puis essai de dioxyde de chlore à fabriquer soi-même avec une prise toutes les 2 heures nuit et jour. C’est vraiment difficile.
Le PSA monte et descend mais reste au-dessous de 1 jusque 2019.
L’été passé, lassé de 11 années de traitements divers je n’ai rien fait malgré un PSA le 27/6 de 3,42, (j’avais osé stopper l’hormonothérapie 1 trimestre, j’ai donc repris). Au contrôle du 29/8 PSA : 10,20.
Je prends le régime strict cétogène et le traitement métabolique : acide alpha lipoïque 3 X 600mg/j ; Hydroxycitrate 3 X 500mg/j, j’y ajoute du bleu de méthylène à raison de 4 prises de 90 mg chaque 6 heures. (Demi-vie 5h30)

Début 9/19 l’oncologue me laisse 1 mois à ma demande.
Le 16/10 je suis à 9,70 je revois l’oncologue interloqué, la courbe ascendante est stabilisée.
Je sais pertinemment que passé 8 un PSA post-op qui triple en un mois signifie une généralisation rapide l’oncologue veut des chimios je refuse et demande un mois.
J’avais mal suivi le régime cétogène ! trop de gras et trop de protéines. (ça fait des glucoses)
Après le 7/10 je suis toujours en hormonothérapie, je prends des vitamines D et B6 et B12 et C. Le bleu de méthylène. Mais là je fais attention pour mon régime et j’ajoute 2 x 850mg de metformine /J au traitement métabolique.

Résultat le 18/12 PSA 3,71.
Avec les fêtes j’ai légèrement abandonné le côté strict. Le 27/02 PSA 4,15.
Donc depuis début février, même traitement sauf metformine à 3 x 850mg/j avec régime plus libre. Résultat PSA du 06 avril (il y a 3 jours) 3,72.
Mais le 28 mars début de montée de température, crampes articulaires et musculaires, les 29/30/31/ et O1 /02 avril température autour de 38, pression au niveau de la gorge, pas de difficulté réelle de respiration, appétit faible mais présent. Je n’ai pas arrêté le BM/4/j/80mg.
J’ai stoppé le métabloc et la metformine. Reprise dès le 4 avril.

Le Jeudi déjà la température baisse et redevient normale le vendredi. Les urines avaient perdu leurs couleurs (étrange) retour de la couleur le jeudi. Les urines deviennent plus colorées que la normale.
Lundi 6 avril passage à l’institut Bordet de Bruxelles (prise de sang PSA) impossible de se faire tester.
Passage aussitôt aux urgences et tri de l’hôpital St Pierre (100m plus loin) explications devant plusieurs médecins et auscultations qui vous admettent à l’étape suivante, je suis donc allé jusqu’à l’étape final où après mes explications et le traitement que je suis et ai suivi, après encore une auscultation (je toussais encore) cette médecin a conclu à un Covid-19 positif, m’a conseillé de continuer mon traitement qui l’étonnait (je fais partie des groupes à risque, 70 ans, métastases, antécédents pulmonaires).

Nous serons le 10 avril dans deux heures et je me sens en pleine forme, et je travaille tous les jours dans mon jardin.
Merci Dr Schwartz !!!

Yann Patou

 

Léa Montégut

Roles Conceptualization, Data curation, Investigation, Methodology,
Writing – original draft, Writing – review & editing



Affiliation
Department of Chemical Engineering, Research Laboratory

in Applied Metabolic Engineering, École Polytechnique de Montréal,
Montréal, Québec, Canada

Pablo César Martínez-Basilio

Roles Conceptualization, Methodology



Affiliation
Department of Chemical Engineering, Research Laboratory

in Applied Metabolic Engineering, École Polytechnique de Montréal,
Montréal, Québec, Canada

Jorgelindo da Veiga Moreira

Roles Conceptualization



Affiliation
Department of Chemical Engineering, Research Laboratory
in Applied Metabolic Engineering, École Polytechnique de Montréal,
Montréal, Québec, Canada

Laurent Schwartz

Roles Conceptualization


Affiliation Assistance Publique des Hôpitaux de Paris, Paris, France

Mario Jolicoeur

Roles Conceptualization, Formal analysis, Funding acquisition,
Investigation, Methodology, Project administration, Supervision, Writing – original draft, Writing –
review & editing


mario.jolicoeur@polymtl.ca



Affiliation
Department of Chemical Engineering, Research Laboratory
in Applied Metabolic Engineering, École Polytechnique de Montréal,
Montréal, Québec, Canada